Kwaliteitswaarborging

Datura hanteert strikte protocollen om de kwaliteit van analyses te kunnen waarborgen. Voornamelijk bij detectie van zeer lage concentraties DNA, zoals bij eDNA, is dit van groot belang. De door ons ontwikkelde eDNA analyses zijn zeer gevoelig en kunnen één DNA molecuul in een sample detecteren. Het is daarom van essentieel belang dat contaminatie voorkomen wordt. Één molecuul kan immers een vals positief resultaat veroorzaken.

Bovendien hebben resultaten van DNA analyses vaak vergaande juridische consequenties en zijn daarom van hoge kwaliteit. Enkele aspecten die de kwaliteit waarborgen worden hieronder nader toegelicht. Heeft u vragen over hoe wij te werk gaan, dan kunt u uiteraard contact met ons opnemen. Datura streeft ernaar om zo transparant mogelijk te werken!

Strikt gescheiden pre- en post PCR ruimtes

Een van de belangrijkste maatregelen om te voorkomen dat er contaminatie plaats vindt is het werken in strikt gescheiden pre- en post PCR ruimtes. Tijdens een PCR wordt een deel van het DNA zeer vaak gekopieerd (geamplificeerd) om het DNA te kunnen detecteren. Vaak bevatte eDNA samples slechts één of enkele DNA moleculen van de doelsoort(en). Deze eDNA samples mogen daarom absoluut niet in aanraking komen met geamplificeerde samples.

De DNA sample kits worden in een DNA vrije ruimte samengesteld. Ook de PCR mixen worden in deze DNA vrije ruimte voorbereid. De DNA sample kits en PCR-buizen worden afgesloten voor ze naar het pre-PCR lab worden vervoerd. In de pre-PCR ruimte worden samples geëxtraheerd en worden de samples toegevoegd aan de PCR mixen. Samplebuizen of -platen worden afgesloten en vervolgens geamplificeerd in een post-PCR ruimte. Er geldt strikt eenrichtingsverkeer tussen de DNA vrije ruimte, het pre-PCR en het post-PCR laboratorium. Als een medewerker van Datura eenmaal in de post-PCR ruimte geweest, is het niet toegestaan om dezelfde dag terug te gaan naar de pre-PCR ruimte.

Steriel werken in UV-kabinetten

Het samenstellen van DNA sample kits en het bereiden van de PCR mixen wordt gedaan in UV-kabinetten, in de DNA vrije ruimte. Deze kabinetten zijn zeer schoon, mede doordat eventuele DNA-vervuiling wordt afgebroken door sterke UV lampen. Het pipetteren van samples gebeurd in een ander UV-kabinet dat zich bevindt in het pre-PCR laboratorium. Op deze manier voorkomen we dat reagentia en monsterkits in aanraking kunnen komen met DNA.

Tijdens het gehele analyse proces wordt zeer nauwkeurig gewerkt. Handschoenen worden regelmatig vervangen en er wordt altijd gewerkt met filtertips om te voorkomen dat pipetten gecontamineerd raken.

Negatieve controles

In elke DNA analyse die Datura uitvoert worden negatieve controles gebruikt om te verifiëren dat er geen contaminatie optreedt. Bij eDNA monitoring worden drie typen negatieve controles gebruikt.

  • Er worden regelmatig samples genomen op locaties waar de doelsoort niet voorkomt. Deze samples moeten uiteraard negatief zijn. Het negatief zijn van deze monsters geeft een indicatie dat er gedurende de bemonstering en analyse geen contaminatie optreedt en dat de reactie 100% specifiek is. Dat wil zeggen dat uitsluitend de aanwezigheid van de doelsoort leidt tot een positief signaal.
  • Er worden extracties uitgevoerd waar geen eDNA sample aan toegevoegd wordt. Aan de hand van deze extractie controles kan geverifieerd worden dat er geen contaminatie optreedt tijdens de DNA extractie.
  • In iedere PCR die Datura uitvoert worden negatieve controles meegenomen die laten zien dat de PCR reagentia niet vervuild zijn en dat er geen contaminatie optreedt tijdens het pipetteren van de samples in de 96-wells plaat.

Validatie van eDNA detectie assays

Primers en probes die gebruikt worden om eDNA te detecteren ondergaan grondige tests voordat ze in de praktijk worden toegepast. De zeer gevoelige en soort-specifieke primers en probes worden ontwikkeld met behulp van gespecialiseerde software. Vervolgens worden de primers en probes in het laboratorium getest:

  • Eerst wordt de gevoeligheid van de primerassays getest. De assays moeten zelfs een enkel molecuul in een reactie kunnen detecteren;
  • Vervolgens wordt aan de hand van weefselmonsters van verwante soorten vastgesteld of de primers inderdaad uitsluitend DNA van de doelsoort kunnen detecteren;
  • Tenslotte worden er minimaal 15 eDNA samples genomen op locaties waar de doelsoort niet voorkomt. Deze samples moeten allemaal negatief zijn. Daarnaast worden er samples verzameld op locaties waar de doelsoort wel voorkomt. Dat moet uiteraard leiden tot positief resultaat. Pas dan wordt het eDNA detectie assay toegepast in de praktijk

Hoe vals negatieve eDNA waarnemingen voorkomen worden

  • Per sample worden minimaal 25 subsamples verzameld. Hiermee wordt de kans vergroot dat er eDNA in het sample terecht komt;
  • Een zeer gevoelige qPCR detectie wordt uitgevoerd met behulp van 12 replica’s. Wanneer minder replica’s uitgevoerd worden kan er minder gevoelig gedetecteerd worden. Meer dan 12 qPCR replica’s leidt echter niet tot gevoeligere detectie;
  • Gebruik van een zeer korte merker van maximaal 110 basepaar;
  • Van ieder sample wordt vastgesteld of de qPCR detectie geïnhibeerd wordt door storende stoffen. Indien dit het geval is wordt er een extra zuiveringstap uitgevoerd. Vervolgens wordt nogmaals getest of er inderdaad geen inhibitie meer optreedt;
  • Er wordt altijd een positieve controle van doelsoort DNA meegenomen in de qPCR detectie. Deze controle moet altijd resulteren in positieve detectie. Ook als alle samples negatief zijn, kan zodoende vastgesteld worden dat de detectie juist is uitgevoerd.

Datura werkt in UV kasten om de contaminatie kans zo laag mogelijk te houden.

Er geldt strikt eenrichtingsverkeer tussen het pre-PCR en post-PCR laboratorium.