Kwaliteits waarborging

Datura beschikt sinds april 2019 over eigen laboratorium ruimtes waarin strikte protocollen gehanteerd worden om de kwaliteit van analyses te kunnen waarborgen. Voornamelijk bij detectie van zeer lage concentraties DNA, zoals bij eDNA, is dit van groot belang. De door ons ontwikkelde eDNA analyses zijn zeer gevoelig en kunnen één DNA molecuul in een sample detecteren. Het is daarom van essentieel belang dat contaminatie voorkomen wordt. Één molecuul kan immers een vals positief resultaat veroorzaken.

Bovendien hebben resultaten van DNA analyses vaak vergaande juridische consequenties en moeten daarom van hoge kwaliteit zijn. Enkele aspecten die de kwaliteit waarborgen worden hieronder nader toegelicht. Heeft u vragen over hoe wij te werk gaan, dan kunt u uiteraard contact met ons opnemen. Datura streeft ernaar om zo transparant mogelijk te werken!

Werken in vier strikt gescheiden ruimtes

Een van de belangrijkste maatregelen om te voorkomen dat er contaminatie plaats vindt is het werken in strikt gescheiden ruimtes. Tijdens een PCR wordt een deel van het DNA zeer vaak gekopieerd (geamplificeerd) om het DNA te kunnen detecteren. Vaak bevatten eDNA samples slechts één of enkele DNA moleculen van de doelsoort(en). Deze eDNA samples mogen daarom absoluut niet in aanraking komen met geamplificeerde samples. Om deze reden werken we in vier gescheiden ruimtes:

• Cleanroom: DNA vrije ruimte. In deze ruimte is sprake van overdruk zodat DNA van buiten niet binnen kan komen.  Daarnaast wordt alle lucht die binnen komt eerst gefilterd door HEPA filters. In deze ruimte worden sample kits samengesteld en worden reagentia zoals PCR-mixen voorbereid;
• eDNA ruimte: Ook in deze ruimte is sprake van overdruk. Hier worden uitsluitend eDNA watersamples en bodemsamples verwerkt, ofwel samples met lage concentraties target DNA;
• Pre-PCR ruimte. In deze ruimte is sprake van onderdruk, zodat eventuele DNA vervuiling in de lucht direct afgevoerd wordt. In deze ruimte worden weefselsamples en keutels verwerkt;
• Post-PCR ruimte. In deze ruimte worden (q)PCRs uitgevoerd. Hier zijn dan ook zeer hoge concentraties DNA aanwezig. Ook in deze ruimte is sprake van onderdruk.

Er geldt strikt eenrichtingsverkeer tussen het DNA vrije laboratorium, het eDNA laboratorium, het pre-PCR en het post-PCR laboratorium. Als een medewerker van Datura eenmaal in de post-PCR ruimte is geweest, is het niet toegestaan om dezelfde week terug te gaan naar een van de andere 3 laboratoria ruimtes.

In de eDNA ruimte en in de pre-PCR ruimte worden samples geëxtraheerd en worden de samples toegevoegd aan de PCR mixen, dit wordt altijd gedaan in UV kabinetten. Samplebuizen of -platen worden luchtdicht afgesloten en vervolgens geamplificeerd in de post-PCR ruimte.

Steriel werken in UV-kabinetten

3 van onze laboratoria ruimten bevatten een UV-kabinet, de cleanroom, eDNA ruimte en Pre-PCR ruimte. Het UV licht in deze kabinetten breekt achtergebleven DNA in het kabinet af, daarnaast blaast het kabinet alle lucht naar buiten en komt er alleen lucht binnen via sterke HEPA-filters in het kabinet.

In het kabinet in de cleanroom worden (q)PCR mixen voorbereid. In de kabinetten van het eDNA lab en de PRE-PCR ruimte worden samples in de kabinetten toegevoegd aan de mixen. Op deze manier voorkomen we zo veel mogelijk dat reagentia  in aanraking kunnen komen met rondzwevend DNA.

Tijdens het gehele analyse proces wordt zeer nauwkeurig gewerkt. Handschoenen worden regelmatig vervangen en er wordt altijd gewerkt met filtertips om te voorkomen dat pipetten gecontamineerd raken.

Negatieve controles

In elke DNA analyse die Datura uitvoert worden negatieve controles gebruikt om te verifiëren dat er geen contaminatie optreedt. Bij eDNA monitoring worden drie typen negatieve controles gebruikt.

• Er worden regelmatig samples genomen op locaties waar de doelsoort niet voorkomt. Deze samples moeten uiteraard negatief zijn. Het negatief zijn van deze monsters geeft een indicatie dat er gedurende de bemonstering en analyse geen contaminatie optreedt en dat de reactie 100% specifiek is. Dat wil zeggen dat uitsluitend de aanwezigheid van de doelsoort leidt tot een positief signaal.
• Er worden extracties uitgevoerd waar geen eDNA sample aan toegevoegd wordt. Aan de hand van deze extractie controles kan geverifieerd worden dat er geen contaminatie optreedt tijdens de DNA extractie.
• In iedere PCR die Datura uitvoert worden negatieve controles meegenomen die laten zien dat de PCR reagentia niet vervuild zijn en dat er geen contaminatie optreedt tijdens het pipetteren van de samples in de 96-wells plaat.

Validatie van eDNA detectie assays

Primers en probes die gebruikt worden om eDNA te detecteren ondergaan grondige tests voordat ze in de praktijk worden toegepast. De zeer gevoelige en soort-specifieke primers en probes worden ontwikkeld met behulp van gespecialiseerde software. Vervolgens worden de primers en probes in het laboratorium getest:

• Eerst wordt de gevoeligheid van de primerassays getest. De assays moeten zelfs een enkel molecuul in een reactie kunnen detecteren;
• Vervolgens wordt aan de hand van weefselmonsters van verwante soorten vastgesteld of de primers inderdaad uitsluitend DNA van de doelsoort kunnen detecteren;
• Tenslotte worden er minimaal 15 eDNA samples genomen op locaties waar de doelsoort niet voorkomt. Deze samples moeten allemaal negatief zijn. Daarnaast worden er samples verzameld op locaties waar de doelsoort wel voorkomt. Dat moet uiteraard leiden tot positief resultaat. Pas dan wordt het eDNA detectie assay toegepast in de praktijk

Hoe vals negatieve eDNA waarnemingen voorkomen worden

• Per watersample worden minimaal 28 subsamples genomen. Hiermee wordt de kans vergroot dat er eDNA van de doelsoort in het sample terecht komt;
• Per bodemsample worden minimaal 20 subsamples genomen. Hiermee wordt de kans vergroot dat er eDNA van de doelsoort in het sample terecht komt;
• Een zeer gevoelige qPCR detectie wordt uitgevoerd met behulp van 12 replica’s. Wanneer minder replica’s uitgevoerd worden kan er minder gevoelig gedetecteerd worden. Meer dan 12 qPCR replica’s leidt echter niet tot gevoeligere detectie;
• Gebruik van een zeer korte merker van maximaal 110 basepaar;
• Van ieder sample wordt vastgesteld of de qPCR detectie geïnhibeerd wordt door storende stoffen. Indien dit het geval is wordt er een extra zuiveringstap uitgevoerd. Vervolgens wordt nogmaals getest of er inderdaad geen inhibitie meer optreedt;
• Er wordt altijd een positieve controle van doelsoort DNA meegenomen in de qPCR detectie. Deze controle moet altijd resulteren in positieve detectie. Ook als alle samples negatief zijn, kan zodoende vastgesteld worden dat de detectie juist is uitgevoerd.